產(chǎn)品介紹

基 因 型MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, cyhr2, LYS2 : : GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3, MEL1 URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ簡 要 說 明 Y190菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實驗用菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蚺cMATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為: trp1，leu2，cyh2；報告基因為： lacZ，HIS3，MEL1。Y190-GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：(pGB和pACT2)或（pGBKT7和pGADT7）。質(zhì)粒pGB由pGBKT7改造而來，篩選標(biāo)志為TRP1，用于表達(dá)DNA-BD(來自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒pACT2與pGADT7的結(jié)構(gòu)和功能類似，篩選標(biāo)志為LEU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系統(tǒng)原理：一個完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結(jié)構(gòu)域：位于N端1~174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結(jié)合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD不與AD結(jié)合，將要檢測的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成 bait融合蛋白(bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey發(fā)生相互作用，就會促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。Y190感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，pGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。操 作 說 明1. Carrier DNA 在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態(tài)，步驟如下：Carrier DNA 放95℃水浴或金屬浴3 min，快速插入冰中，靜置3 min，再次放95℃水浴或金屬浴3 min，快速插入冰中，靜置3 min以上。2. 取100 µl冰上融化的Y190感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒0.5-3 µg，Carrier DNA10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打幾次混勻，30℃水浴30 min (15 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。4. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH2O 400 µl 重懸，離心 30s棄上清。5. ddH2O 50 µl重懸，涂板，29℃培養(yǎng)48-96 h。注 意 事 項1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。3. 同時轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時應(yīng)增加質(zhì)粒的用量。4. Y190酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長中一個常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。

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