產(chǎn)品介紹

基 因 型MATahis3200trp1-901leu2-3,112ade2LYS2::(lexAop)4-HIS3ura3::(lexAop)8-lacZade2::(lexAop) 8-ADE2 GAL4簡 要 說 明DUALmembrane系統(tǒng)是DUALsystems BioTech公司開發(fā)的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測技術，它利用分離的泛素系統(tǒng)（split-ubiquitin）直接檢測天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用，是目前市面上唯一檢測膜蛋白間相互作用的酵母雙雜系統(tǒng)。此系統(tǒng)采用NMY51酵母菌株，可直接轉化質(zhì)粒進行蛋白互作驗證或篩庫試驗；此菌株Transformation  marker為:  trp1, leu2-3，報告基因為：HIS3, ADE2 和lacZ，第一步通過營養(yǎng)缺陷型報告基因（HIS3, ADE2）進行選擇性生長篩選，進一步通過 LacZ 報告基因進行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個獨立的報告基因，受不同啟動子的調(diào)控，降低假陽性幾率。原理：泛素（ubiquitin）分子量很小，由 76aa 殘基組成；泛素作為降解信號分子，可以連接另外一種蛋白質(zhì)的 N 端，然后被泛素專一性蛋白酶（UBPs）識別，從而導致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分：N 端（Nub），C 端（Cub）。首先，人為地將泛素 Nub 的 3 位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼幔∟ubI 突變?yōu)镹ubG）。這樣與 Cub 的親合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我結合或接近的可能性。其次，將Cub 部分與人工合成的 LexA-VP16 轉錄激活因子融合成一個融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下 NubG不與Cub 結合，UBPs 也不能識別分離的泛素，轉錄激活因子也不會被切下來。最后，將要檢測的蛋白質(zhì)分別與NubG和Cub融合，形成 bait 融合蛋（bait-cub-LexA -VP16）和 prey 融合蛋白（prey-NubG）。如果 bait 和 prey發(fā)生相互作用，就會促使 NubG 和 Cub 的相互接近，被 UBPs 識別，導致 LexA-VP16 的解離，進入核內(nèi)，從而激活報告基因的轉錄。 此系統(tǒng)可使用四種Bait質(zhì)粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標志均為LEU；三種Prey質(zhì)粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標志均為TRP。High5TM系列NMY51感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，經(jīng)PGADT7質(zhì)粒檢測轉化效率>104cfu/μg DNA 。操 作 說 明1.取1管感受態(tài)細胞置冰上融化，6 000 rpm離心1min，去掉上清。2.加入320 μl LiTE/PEG溶液，重懸細胞，然后加入10μl Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復一次)，預冷目的質(zhì)粒2-5ug,體積不多于20ul。3.充分混勻，于30度250 rpm轉速下培養(yǎng)30 min。4.42度熱激2.5min。5.6000 rpm離心1min，去掉上清。6.加入1 ml TE溶液，溫和重懸細胞。7.6000 rpm離心1min，去掉上清。8.加入100 μl TE溶液，重懸細胞，將細胞涂布于相應的營養(yǎng)缺陷型固體合成培養(yǎng)基。9.30度倒置培養(yǎng)48-96h，直至形成大小合適的酵母菌落。 Preparation of Media：YPDA （1L）:Tryptone               20gyeast extract             10g 0.2% adenine            15ml補水到 950ml，  用鹽酸調(diào)PH到 6.5Agar                 20g (for plates only)121度，15分鐘高壓滅菌，待培養(yǎng)基溫度降到55度時，加入已過濾的40% 葡萄糖 50 ml 0.2% adenine(1L)Adenine    2g補水到1L，溶解后高壓滅菌或0.22um濾膜過濾除菌注 意 事 項1.感受態(tài)細胞最好在冰上融化。2.轉化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。3.同時轉化2-3種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。4.NMY51酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉化效率呈指數(shù)下降。5.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養(yǎng)可見直徑1mm克?。煌縎D單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆。

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