產(chǎn)品介紹

基 因 型MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ簡 要 說 明AH109菌株來源于PJ69-2A 酵母菌株，將lacZ報(bào)告基因引入PJ69-2A誕生了AH109，此菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蚺cMATα型酵母菌株Y187通過mating操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫試驗(yàn)。Transformation  marker為: trp1, leu2，報(bào)告基因?yàn)椋簂acZ, HIS3, ADE2, MEL1。AH109 -GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。質(zhì)粒PGBKT7的篩選標(biāo)志為TRP1，用于表達(dá)DNA-BD(來自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒PGADT7的篩選標(biāo)志為LEU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于N端1 ~ 174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域（DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識(shí)別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結(jié)合。而AD可以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動(dòng)子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD不與AD結(jié)合，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey發(fā)生相互作用，就會(huì)促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。AH109有四個(gè)報(bào)告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分別由三種不同的啟動(dòng)子（GAL1，GAL2，MEL1）啟動(dòng)，這三種啟動(dòng)子只有GAL4識(shí)別的17bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。High5TM系列AH109感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，經(jīng)PGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA 。操 作 說 明1.取1管感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，6 000 rpm離心1min，去掉上清。2.加入320 μl LiTE/PEG溶液，重懸細(xì)胞，然后加入10μl Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復(fù)一次)，預(yù)冷目的質(zhì)粒2-5ug,體積不多于20ul。3.充分混勻，于30度250 rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)30 min。4.42度熱激2.5min。5.6000 rpm離心1min，去掉上清。6.加入1 ml TE溶液，溫和重懸細(xì)胞。7.6000 rpm離心1min，去掉上清。8.加入100 μl TE溶液，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞涂布于相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型固體合成培養(yǎng)基。9.30度倒置培養(yǎng)48-96h，直至形成大小合適的酵母菌落。Preparation of Media：YPDA （1L）:Tryptone                20gyeast extract             10g 0.2% adenine            15ml補(bǔ)水到 950ml，  用鹽酸調(diào)PH到6.5Agar                20g (for plates only)121度，15分鐘高壓滅菌， 待培養(yǎng)基溫度降到55度時(shí)，加 入已過濾的40% 葡萄糖 50 ml0.2% adenine(1L)Adenine    2g補(bǔ)水到1L，溶解后高壓滅菌或0.22um 濾膜過濾除菌注 意 事 項(xiàng)1.感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。3.同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。4.Y2HGold酵母菌株對(duì)高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。5.菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole（AIR）在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆。

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