產(chǎn)品介紹

基 因 型MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met–, MEL1簡 要 說 明Y1HGold菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4-AbA酵母單雜系統(tǒng)用菌株，MATα型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行篩庫試驗(yàn)。Transformation marker為: ura3，leu2；報告基因?yàn)椋篈bAr。Y1HGold -GAL4-AbA酵母單雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：pAbAi和PGADT7。質(zhì)粒pAbAi的篩選標(biāo)志為URA，用于表達(dá) pBait-AbAi construct (1~3個bait DNA序列重復(fù)串聯(lián)后克隆到pAbAi中)；質(zhì)粒PGADT7的篩選標(biāo)志為LEU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4-AbA酵母單雜系統(tǒng)原理：Aureobasidin A (AbA)是一種環(huán)酯肽抗生素，在低濃度(0.1-0.2ug/ml) 下即可對酵母產(chǎn)生毒性?；蚪M中整合了pBait-AbAi 的酵母菌株（Bait-Reporter Yeast Strains），當(dāng)獵物蛋白（Prey）結(jié)合到誘餌序列（Bait DNA）上，GAL4 AD就會激活A(yù)bAr 的表達(dá)，從而能夠在含有抗生素AbA的培養(yǎng)基上生長。AbAr與營養(yǎng)缺陷報告基因相比具有更低背景的優(yōu)點(diǎn)，可以降低酵母單雜假陽性發(fā)生的概率。High5TM系列Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，經(jīng)pAbAi質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>103cfu/μg DNA 。操 作 說 明1.取pBait-AbAi質(zhì)粒5ug，BstBI 或 BbsI酶切1小時，回收。2.取100 μl冰上融化的Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的線性pBait-AbAi質(zhì)粒1-5ug（體積不高于15ul），Carrier DNA（95-100度5min,快速冰浴，重復(fù)一次）10 ul ，PEG/LiAc  500ul并吸打幾次混勻，30度水浴30 分鐘（15 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻）。3.將管放42度水浴15min（7.5 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻）。 4.5000 rpm離心40s棄上清，ddH2O 400ul重懸，離心30s棄上清。5.ddH2O 50ul重懸，涂SD/-Ura平板,29℃培養(yǎng)72h。6.挑取5-10個克隆，用PCR方法確定pBait-AbAi整合到Y(jié)1HGold基因組中，PCR陽性菌株在SD/-Ura平板劃線，29℃培養(yǎng)72h，4℃保存，此菌株即是Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。Preparation of Media：YPDA （1L）:Tryptone                20gyeast extract             10g 0.2% adenine           15ml補(bǔ)水到 950ml，  用鹽酸調(diào)PH到6.5Agar                 20g (for plates only)121度，15分鐘高壓滅菌，待培養(yǎng)基溫度降到55度時，加入已過濾的40% 葡萄糖 50 ml0.2% adenine(1L)Adenine    2g補(bǔ)水到1L，溶解后高壓滅菌 或0.22um 濾膜過濾除菌注 意 事 項(xiàng)1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。3.同時轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。4.Y1HGold酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。5.菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長中一個常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole（AIR）在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養(yǎng)可見直徑1mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆。

此產(chǎn)品需要干冰運(yùn)輸發(fā)貨，會根據(jù)路途及包裝大小收取一定的干冰運(yùn)費(fèi)。