產(chǎn)品介紹

BL21 是最早開發(fā)的用于原核表達(dá)的菌株，BL21（DE3）、Rosetta、OrigamiB(DE3) 等一系列原核表達(dá)菌株均來源于 BL21 菌株。該菌株主要用于非毒性蛋白的表達(dá)，不含 T7 RNA 聚合酶，所以不能用于由 T7 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的蛋白表達(dá)(如：pET 系列)；但含有大腸桿菌 RNA 聚合酶，可以用于 tac 或 trc 等使用大腸桿菌 RNA 聚合酶的原核系統(tǒng)的表達(dá)（如：pGEX，pMAL 質(zhì)粒）。AngYuBio High5 TM 系列 BL21 電擊感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，經(jīng) pUC19 質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá) 10 9 cfu/μg。

操作說明

1. 0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5 分鐘，待其瀝干水分，正置 5 分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面 0.5 cm 以方便蓋上杯蓋，冰中靜置 5 分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的 BL21 電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中 5 分鐘，待其融化，加入目的 DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手撥打 EP 管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。

A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19；

B. 對(duì)鹽濃度較高的 DNA 溶液或反應(yīng)體系請(qǐng)用乙醇沉淀 DNA 后加入適量 TE 緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，然后與電擊感受態(tài)混合進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。

3. 用 200 μl 槍頭(用刀切除 0.5cm 槍尖)將感受態(tài)-DNA 混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為 BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2 分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入 700 μl 不含抗生素的無菌 S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用 1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到 50 ml 離心管（BD Falcon 50 ml 錐形離心管等），向離心管中補(bǔ)加 S.O.C. 培養(yǎng)基至 10 ml。37℃，225 rpm 復(fù)蘇 60 分鐘。

6. 5000 rpm 離心一分鐘收菌，重懸后取 100-200 μl 涂布到含相應(yīng)抗生素的 S.O.C 平板上（因菌量較大，若全部涂板請(qǐng)選用直徑 15cm 培養(yǎng)皿 2-5 個(gè)）。將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng) 13-17 小時(shí)。

注意事項(xiàng)

1. 加入 DNA 時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的 1/10。

2. 電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。

3. 當(dāng) DNA 不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和 DNA 的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

6. 加入 DNA 濃度不能過高，最好不超過 100 ng/μl。過高濃度質(zhì)粒會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

7. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

8. 電擊感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。

此產(chǎn)品需要干冰運(yùn)輸發(fā)貨，會(huì)根據(jù)路途及包裝大小收取一定的干冰運(yùn)費(fèi)。